Onderzoekers hebben met AI-software AlphaFold varianten van het genbewerkingsenzym Cas9 ontworpen die minder vaak ongewenst DNA aanpassen. Bij een geteste variant daalde de activiteit buiten het beoogde doelwit van 28 procent naar 5 procent, terwijl de werking op het juiste DNA grotendeels behouden bleef.
CRISPR-systemen gebruiken een gids-RNA om een specifieke DNA-sequentie te vinden. Het Cas-eiwit bindt vervolgens aan die plek, waarna een ander enzym het DNA kan veranderen. Maar het systeem kan soms ook binden aan bijna gelijke DNA-sequenties elders in het genoom, waardoor daar onbedoelde wijzigingen ontstaan.
Die zogeheten off-target-effecten zijn een veiligheidsprobleem voor behandelingen die genbewerking toepassen. Een menselijke cel bevat ongeveer 3 miljard DNA-basen en therapieën moeten vaak grote aantallen cellen aanpassen. Zelfs zeldzame vergissingen kunnen daardoor relevant worden.
Verschillen in eiwitcontacten
Het onderzoeksteam stelde eerst een uitgebreide verzameling samen van DNA-plekken waar ongewenste bewerking optrad, met tien verschillende gids-RNA's. Daarna lieten de onderzoekers AlphaFold berekenen hoe Cas9, het gids-RNA en doel-DNA zich bij correcte en afwijkende doelwitten tot elkaar verhouden.
De eerste berekeningen, waarin ook het DNA-aanpassende enzym was opgenomen, leverden geen bruikbare structuur op. Met alleen Cas9, DNA en gids-RNA kwamen de voorspellingen wel overeen met eerder experimenteel vastgesteld onderzoek naar zulke complexen.
Bij ongeveer twee derde van de ongewenste doelwitten nam Cas9 een iets andere vorm aan. Bij meer dan 95 procent veranderden de contacten tussen aminozuren van Cas9 en het RNA. De onderzoekers ontwikkelden op basis daarvan een analysemethode, ContactSeek, die aminozuren aanwijst waarvan het contact met RNA verschuift bij een mismatch tussen gids-RNA en DNA.
Gerichte aanpassingen
De onderzoekers concentreerden zich op groepen van zulke aminozuren in Cas9 en maakten 23 varianten, met veranderingen op tien geselecteerde posities. Daarmee vonden zij een Cas9-variant die het gewenste doelwit ongeveer even goed bewerkte, maar aanzienlijk minder actief was op een ongewenste plek.
De aanpak werkte ook met andere gids-RNA's en bij Cas12, een ander eiwit dat in CRISPR-systemen DNA herkent. Bestaande methoden hebben eveneens Cas-varianten opgeleverd met minder off-target-effecten, onder meer via gerichte evolutie. De nieuwe varianten waren bij vergelijkende tests vergelijkbaar of iets beter in nauwkeurigheid en activiteit.
De gevonden aanpassingen lijken vooral bruikbaar voor specifieke combinaties van gids-RNA en ongewenste DNA-overeenkomsten. De onderzoekers hebben niet onderzocht of deze veranderingen kunnen worden gecombineerd met eerder ontwikkelde, nauwkeurigere Cas9-varianten. De methode kan ook worden gebruikt om andere interacties tussen eiwitten en DNA gerichter af te stemmen.
